| Abstract | UVOD
Egzosomi su membranske vezikule endocitnog podrijetla, koje se smatraju važnim
čimbenicima u međustaničnoj komunikaciji. Mlijeko je vrlo složenog sastava koji osigurava
adekvatnu prehranu, prijenos imuniteta i potiče adekvatan razvoj odojka. Smatra se da
egzosomi mlijeka imaju ključnu ulogu u tim procesima, ali ih tek treba dodatno istražiti, kao i
prijenosne mehanizme u kojima sudjeluju egzosomi u različitim fazama laktacije, te njihovu
ulogu koja je važna je za razumijevanje različitih čimbenika tijekom laktacije, kao i za
poboljšanje mliječnih nadomjestaka za ljude i životinje. Proteom i lipidom izvanstaničnih
vezikula (EV) sadrži proteinske sastojke i različite druge aktivne tvari; promjene u tim
odjeljcima mogle bi utjecati na njihovu ulogu u komunikaciji između stanica. Poznato je da
omjer ω-6 i ω-3 višestruko nezasićenih masnih kiselina (PUFA) u prehrani utječe na zdravlje i
upalu te izaziva promjene u sastavu masnih kiselina u mlijeku, ali do sada nijedno istraživanje
nije uključivalo frakciju EV u mlijeku. Cilj ovog istraživanja bio je istražiti kako se mijenja
sastav egzosoma mlijeka tijekom prijelaza s kolostruma u fazu odbića odojaka, te kako dva
različita omjera ω-6 i ω-3 mliječnih kiselina utječu na lipidom i proteom egzosoma mlijeka i
kolostruma krmača.
MATERIJALI I METODE
Šesnaest krmača, plotkinja koje su se više puta prasile, te su nasumično raspoređene u dva
dijetalna tretmana: kontrolna skupina (Skupina S - GS) primala je standardnu prehranu s
omjerom ω-6:ω-3 od 13:1 od 28. dana gravidnosti do prasenja, te u omjeru od 10:1 tijekom
laktacije); a druga (tretirana) skupina (Grupa L - GL) hranjena je obrokom s niskim omjerom
ω-6:ω-3 (4:1 od 28. dana gravidnosti do kraja laktacije, tj. 24 dana nakon prasenja). Uzorci
mlijeka prikupljeni su 0, 7 i 14 dana nakon partusa tijekom prirodnog izlučivanja mlijeka,
zamrznuti odmah nakon prikupljanja i čuvani na -80 °C do izolacije egzosoma. Egzosomi su
izolirani ultracentrifugiranjem u kombinaciji s kromatografijom isključenja po veličini čestica (SEC), karakterizirani analizom praćenja nanočestica (NTA) pomoću NanoSight NS300
instrumenta, zatim transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) i metodom Western
blot. Izolirani egzosomi pripremljeni su za digestiju u gelu, zatim za obilježavanje peptida
izobarnim privjescima (TMT) te analizirani pomoću spektrometra masa spregnutog s
tekućinskom kromatografijom (LC-MS/MS). Statističke analize podataka na razini
podudaranja peptidnog spektra (PSM) provedene su u ‘’R’’ programu, verzija 3.6 , korištenjem
,,in house’’ razvijenog protokola. Analiza genske ontologije (GO) i analiza bioloških puteva
provedeni su u STRING softverskoj verziji 11.0 i Cytoscapeu v3.8.2. pomoću ClueGO
aplikacije. Lipidi su ekstrahirani Folch metodom, a lipidom izoliranih egzosoma određen je LCMS/MS spektrometrijom masa. Analiza podataka o lipidima provedena je u MS-DIAL programu primjenom baze podataka LipidBlast, a statistička analiza provedena je na programu MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca).
REZULTATI I RASPRAVA
Egzosomi mlijeka krmača karakterizirani su analizom praćenja nanočestica, transmisijskim
elektronskim mikroskopom i metodom Western blot. Promjene u hranidbi i odnos između
vremena i tretmana nisu dali razlike u veličini EV, dok su različite faze laktacije (kolostrum
naspram mlijeka) dale razlike. Prosječni EV promjer nije se razlikovao (p = 0,6) između dvije
skupine (GL = 151 ± 18,5; GS = 154 ± 19,3; (± SD u nm), za izolaciju korištenu u proteomskoj
analizi; i GL = 162 ± 14,7 GS = 156 ± 20,6 , za izolaciju korištenu u analizi lipida). Populacija
egzosoma bila je nešto manja u kolostrumu (139 ± 19 nm u izolaciji korištenoj u analizi
proteoma; i 147 ± 21,3 u izolaciji korištenoj u analizi lipida) od mlijeka (162 ± 12,5 u izolaciji
primijenjenoj u proteomskoj analizi; i 162 ± 18 u izolaciji koja se koristi u analizi lipida).
Ispitivanje TEM metodom pokazalo je okrugle i poput čaše, konkavne sfere s morfologijom
kompatibilnom s egzosomima. TSG101, proteinski marker egzosoma, detektiran Western blot
metodom, bio je prisutan u mlijeku i egzosomima kolostruma u obje skupine. Rezultati analize
metodom spektrometrije masa (LC-MS/MS) također su mapirani prema bazi podataka
ExoCarta za oznake egzosoma, a svih 10 najboljih markera bilo je prisutno u uzorcima.
LC-MS/MS analiza mapirala je 3989 peptida koji predstavljaju 637 proteina. Nakon što su
primijenjeni kriteriji isključenja (FDR ≤ 0,5% i najmanje dva jedinstvena peptida, uklanjanje
suvišnih peptidno-spektralnih podudaranja, single-shot proteina i peptida s visokom
interferencijom izolacije), ukupno je 319 proteina u svakoj vremenskoj točki korišteno za
statističku analizu. Kvantitativna proteomska analiza otkrila je različite profile proteoma za egzosome kolostruma i egzosome mlijeka. Egzosomi iz kolostruma imali su 162 različito zastupljena proteina (DAP) (82 povećana i 80 smanjena) u usporedbi s egzosomima iz mlijeka 7. dana, a 170 DAP (81 povećan i 89 smanjen) iz mlijeka 14. dana. Varijacije u proteomu unutar
skupina s različitom hranidbom ustanovljene su 7. dana, s razlikama u zastupljenosti proteina spondina-2 i glukozom regulirani protein molekularne težine 78 kDa. Nisu pronađene razlike u egzosomima kolostruma između promatranih skupina. Proteini s funkcijama u razvoju imunološkog odgovora, regulaciji staničnih procesa i staničnom razvoju različito su
eksprimirani između kolostruma i egzosoma mlijeka. Funkcionalna analiza istaknula je
povećano eksprimirane biološke puteve povezane s regulacijom homeostaze u egzosomima
kolostruma, te povećano eksprimirane biološke puteve kao što su razvoj endotelnih stanica i
metabolizam lipida u egzosomima mlijeka. Funkcionalna analiza različito eksprimiranih
proteina između promatranih skupina istaknula je molekule važne za vezikulom posredovani
transport (GO:0016192) i transport (GO:0006810), koji bi mogao biti pod utjecajem promjena
u sastavu PUFA.
Lipidomska analiza primjenom spektrometrije masa uspjela je identificirati ukupno 947 lipida
u uzorcima egzosoma mlijeka i kolostruma. Identificirani lipidi uključivali su 25 glavnih klasa
i 47 potklasa lipida. Najzastupljenije klase lipida bili su diradilgliceroli, triradilgliceroli i
fosfosfingolipidi, koji se sastoje od sfingolipida, uglavnom sfingomijelina, koji uključuju
fosforne skupine. U usporedbi s egzosomima kolostruma, identificirali smo 734 različito
zastupljena lipida u egzosomima mlijeka 7. dana i 779 DAL 14. dana. U usporedbi s
egzosomima iz mlijeka 7. dana, egzosomi kolostruma imali su niži diacilglicerol (DG) (n =
176), triacilglicerol (TG) (n = 70), fosfatidilkolin (PC) (n = 62), sfingomijelin (SM) (n = 50),
masne kiseline (FA9 (n = 48) i fosfatidiletanolamin (PE) (n = 48), a za razliku između dana 0 i
dana 14, egzosomi kolostruma imali su niži DG ( n = 193), TG (n = 81), PC (n = 61), Cer (n =
61), PE (n = 60), SM (n = 58) i FA (n = 48). Nisu uočene značajne razlike u lipidnom sastavu
egzosoma mlijeka između 7. i 14. dana, a uglavnom nema razlika u sastavu lipida između
tretmana s različitim omjerima hranjenja ω-6 i ω-3 masnih kiselina. Samo jedan lipid (PA
17:0_28:6) bio je smanjen u usporedbi između egzosoma mlijeka iz GS i GL 14. dana. Rezultati
otkrivaju specifičan profil lipida u egzosomima mlijeka krmača u različitim fazama laktacije, s
mogućim implikacijama na njihovu funkcionalnu biologiju, uključujući razvoj strategija koje
koriste upotrebu mliječnih egzosoma kao nosača za isporuku lijekova ili aditiva.
ZAKLJUČCI
Ova studija potvrđuje važnost egzosoma kao aktivnih biokomponenti mlijeka i daje nove
temelje za buduća istraživanja uloge egzosoma u regulaciji imuniteta i razvoju odojaka.
Identificirani funkcionalni proteom i dobivene mreže interakcija među proteinima u našoj
studiji pomažu razjasniti ulogu egzosoma mlijeka u različitim razdobljima laktacije. Buduće
studije istražit će daljnje učinke prehrane na sastav izvanstaničnih vezikula (EV) u mlijeku i
njihov odnos prema razvoju mladunčadi. Karakterizacija lipida pruža znanja o strukturi,
funkciji i stabilnosti egzosoma mlijeka. Dobiveni rezultati su relevantni za osnovno
razumijevanje njihovog utjecaja na razvoj odojka, ali i za strategije koje uključuju upotrebu
egzosoma mlijeka kao sredstva za prijenos lijekova ili aditiva te unaprijeđenje znanja za
proizvodnju zamjenskih mliječnih proizvoda. |
| Abstract (english) | Exosomes are membranous vesicles considered major players in cell-cell communication.
Milk provides adequate nutrition, transfers immunity, and promotes neonate
development, and milk exosomes are suggested to have a key role in these processes. The
ratio of dietary omega-6:omega-3 (ω-6:ω-3) polyunsaturated fatty acids (PUFA) affects
health and inflammation, and can induce changes in milk fatty acid composition, but no
reports have included the proteome and the lipidome of the exosomal fraction. Milk
samples were obtained on days 0, 7, and 14 after parturition from sows receiving either a
standard diet (ω-6:ω-3 = 13:1), or a test diet enriched in ω-3 (ω-6:ω-3 = 4:1), and
exosomes were isolated using ultracentrifugation coupled with size exclusion
chromatography, and characterized by nanoparticle tracking analysis, transmission
electron microscopy, and assessment of exosomal markers via Western blotting. The
proteome was explored using a Tandem Mass Tag-based high-resolution quantitative
approach and the lipidome was assessed using untargeted metabolomics by a liquid
chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry approach. A total of 319
proteins in each timepoint were identified in milk exosomes. Exosomes from colostrum
presented 162 differentially abundant proteins (DAP) as compared to exosomes from
milk on day 7, and 170 DAP from milk on day 14. The DAP revealed to be related to
biological functions such as uptake of metabolites, regulation of homeostasis, and cellular
development. A total of 947 lipids from sixteen subclasses were identified in both
colostrum and milk exosomes. When compared to colostrum exosomes, we identified 734
differentially abundant lipids (DAL) in milk exosomes on day 7 and 779 DAL on day 14.
Dietary treatments exerted an effect on the milk exosome proteome but not on their
lipidome. Results unveil a distinct proteomic and lipidomic profile in porcine milk
exosomes in different stages of lactation, with implications for their functional biology,
and are relevant for potential strategies using milk exosomes as vehicles for drug or
additive delivery. |
| Abstract (german) | Exosomen sind membranhaltige Vesikel, denen eine Hauptrolle in der interzellulären
Kommunikation zugesprochen wird. Milch sichert die Nährstoffversorgung, überträgt
Immunität und fördert die optimale Entwicklung von Neugeborenen, wobei Exosomen
wahrscheinlich zentrale Funktion haben. Das Verhältnis von ω-6 zu ω-3 mehrfach ungesättigte
Fettsäuren (PUFA) in der Nahrung nimmt Einfluss auf die Gesundheit und auf
Entzündungsprozesse, und kann auch die Fettsäurezusammensetzung des Milchfetts verändern.
Ob diese Veränderungen auch das Proteom und Lipidom der in der Milch enthaltenen
Exosomen betreffen, ist bisher unzureichend untersucht. Milchproben von Sauen wurden 0, 7
und 14 Tage post partum von Sauen gewonnen, welche entweder einen erhöhten ω-3 (ω-6:ω-3
= 4:1) Anteil in Futter oder eine Standardration (ω-6:ω-3 = 13:1) erhielten. Im Weiteren wurden
die Exosomen aus der Milch mittlels Ultrazentrifugation und
Größenausschlusschromatographie isoliert und anschließend mit Nanopartikel-TrackingAnalyse, Transmissionselektronenmikroskopie und dem Nachweis von Markerproteinen
mittels Western Blot charakterisiert. Das Proteom wurde mittels TandemMassenspektrometrie, das Lipidom mit einem ungerichteten Metabolomics-Verfahren (liquid
chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry) analysiert. Insgesamt wurden
319 Proteine/Zeitpunkt bei den aus der Milch isolierten Exosomen identifiziert. Im Vergleich
zu den Isolaten von Tag 7 post partum wurden bei den aus Kolostrum isolierten Exosomen 162
in unterschiedlicher Menge vorliegende Proteine (differentially abundant proteins; DAP)
gefunden, im Vergleich zu Tag 14 wurden 170 DAP identifiziert. Die DAP weisen auf eine
veränderte biologische Funktion wie z.B. die Aufnahme von Metaboliten, die Regulierung der
Homöostase oder eine veränderte Zellentwicklung hin. Insgesamt wurden in Kolostrum- und
Milchexosomen 947 Lipide aus sechzehn Subklassen identifiziert. Im Vergleich zwischen
Kolostrum- und Milchexosomen wurden an Tag 7 post partum 734 unterschiedlicher Menge
vorliegende Lipide (differentially abundant lipids; DAL) identifiziert und 779 DAL an Tag 14.
Die unterscheidlichen Futterrationen wirkten sich auf das Proteom der Milchexosomen aus,
nicht aber auf ihr Lipidom. Die Ergebnisse zeigen ein unterschiedliches Proteom- und LipidomProfil in Milchexosomen von Sauen in verschiedenen Laktationsstadien, was Auswirkungen
auf ihre funktionelle Biologie hat. Zudem sind die Resultate für mögliche Ansätze zurVerwendung von Milchexosomen als Vesikel für die Verabreichung von Medikamenten oder
Zusatzstoffen von Bedeutung. |
