| Abstract | Escherichia coli (E. coli) is the most common bacterial cause of decreased
production and high mortality rates in the poultry industry. Avian pathogenic E. coli
(APEC) is one of the extraintestinal E. coli (ExPEC) subpathotypes, characterized by
high genetic diversity. Regardless of their diversity, ExPEC strains share many common
virulence factors that allow them to colonize tissues outside of the intestine. APEC
genetic diversity complicates the efficacy of the immunoprophylaxis programs, which
are the foundation of poultry health protection. In this research, 115 E. coli strains were
longitudinally isolated from the chicken carcasses diagnosed with colibacillosis. The
strains originated from four and five flocks, on Farm A and Farm B, respectively, which
are part of the same broiler breeder company. The selected strains originated from the
flocks vaccinated with commercial, combination of commercial and autogenous, or
solely autogenous vaccines. The strains were sequenced, individually analysed and
mutually compared based on the phylogenetic groups, multilocus sequence types
(MLST), virulence-associated genes (VAGs), antimicrobial resistance (AMR) genes,
and core-genome single-nucleotide polymorphisms (cgSNPs). The aim of this
dissertation was to investigate the effect of autogenous vaccines on the genetic
heterogeneity of E. coli strains on poultry farms. The results showed that autogenous
vaccine application gradually induced lower genetic heterogeneity of the isolates on
both farms, based on the prevalence of phylogenetic groups, STs and cgSNP phylogeny.
In total, 23 sequence types (STs) were detected, with 52.58% of the isolates belonging
to two clonal complexes. Nevertheless, the average number of virulence genes per
isolate increased on both farms, while the prevalence of the antimicrobial resistance
genes decreased. Out of the highly prevalent STs, ST95, ST390 and ST131 had the
highest average number of VAGs per isolate. The overall results of the research
confirmed that application of autogenous vaccines affects the genetic heterogeneity and
virulence profiles of E. coli. |
| Abstract (croatian) | UVOD: Kolibaciloza predstavlja značajan problem u peradarskoj industriji, uzrokujući
velike ekonomske gubitke i smanjenje dobrobiti životinja na farmama. Uzrokovana je
bakterijom Escherichia coli (E. coli), koja može biti primarni ili sekundarni patogen,
često u koinfekciji s drugim mikroorganizmima kao što su Mycoplasma ili virus
zaraznog bronhitisa, ili uslijed različitih oblika imunosupresije. Težina infekcije ovisi o
različitim čimbenicima kao što su soj, mjesto ulaska patogena i opće zdravstveno stanje
životinje. U pilića zaraza najčešće nastaje putem nezacijeljenog pupčanog tračka u
valionici ili vertikalnim prijenosom od zaraženog roditeljskog jata. Kod kokoši u
proizvodnji, najčešće lezije uključuju poliserozitis, peritonitis, salpingitis i salpingitisperitonitis sindrom (SPS), pri čemu infekcija nastaje ascendentno putem jajovoda. Iako
infekcija može biti lokalizirana, češće se radi o sistemskoj infekciji, odnosno
septikemiji. Izbijanje bolesti je vrlo često povezano s početkom proizvodnje jaja, pa se
septikemija kod kokoši nesilica smatra bolešću koja je potaknuta stresom.
Sojevi E. coli mogu se podijeliti u crijevne i izvancrijevne (engl. extraintestinal
pathogenic E. coli, ExPEC), pri čemu ptičji patogeni sojevi (engl. avian pathogenic E.
coli, APEC) pripadaju skupini izvancrijevnih sojeva. Svi ExPEC sojevi sadržavaju
čimbenike virulencije koji im omogućavaju preživljavanje i kolonizaciju tkiva izvan
crijeva, ali su genetski vrlo raznoliki, što komplicira detaljnu klasifikaciju i
dijagnostiku. Geni virulencije u APEC sojevima vrlo često su grupirani na otocima
patogenosti (engl. pathogenicity islands, PAIs) koji mogu biti smješteni na
kromosomima ili plazmidima. S obzirom da izrazito virulentni APEC sojevi vrlo često
sadržavaju takve plazmide, oni se smatraju njihovom karakteristikom, iako dosadašnjim
istraživanjima nije uspješno utvrđeno koji pojedini geni virulencije su svojstveni za
APEC sojeve. Rezultati istraživanja različitih ExPEC podskupina pokazali su da su svi
takvi sojevi genetski vrlo slični, što je stvorilo temelj za istraživanje zoonotskog
potencijala APEC sojeva.
U svrhu tipizacije sojeva E. coli korištene su mnoge metode, od kojih se u
današnje vrijeme vrlo često primjenjuje filogenetska tipizacija temeljena na dokazu
gena koji se smatraju reprezentativnima za pojedine filogenetske skupine. Prema
trenutnoj podjeli, postoji osam skupina, te tzv. „cryptic clade“ I-V, pri čemu se skupine
B2, D, F i G smatraju patogenima, dok ostale čine komenzalni sojevi. Primjena takve metode omogućava brzu dijagnostiku i monitoring sojeva E. coli na farmama. U istraživanjima i dijagnostici, sve češće se primjenjuje tehnologija sekvenciranja novih generacija (engl. next-generation sequencing, NGS), koja ima veliki potencijal u
populacijskoj genomici i molekularnoj epidemiologiji. Primjenom metoda
sekvenciranja moguće je pratiti evoluciju bakterijskih populacija, te njihovu prilagodbu
različitim domaćinima.
Zaštita peradi na farmama temelji se na provedbi strogih biosigurnosnih mjera i
primjeni cjepiva. S obzirom da su sojevi E. coli genetski vrlo raznoliki, komercijalne
vrste cjepiva su često nedovoljno učinkovite jer pružaju zaštitu od nekolicine sojeva. Iz
toga razloga, sve češće se koriste autogena cjepiva koja su proizvedena od sojeva
izdvojenih na farmama na kojima će se i primjenjivati, pa su zato vrlo specifična i
učinkovita. Dosadašnja istraživanja pokazala su da primjena autogenoga cjepiva ima
pozitivan utjecaj na zdravlje životinja i njihove proizvodne rezultate. Longitudinalnim
praćenjem genetske strukture populacije E. coli na farmama na kojima se primjenjuje
autogeno cjepivo, može se dobiti uvid o utjecaju cjepiva na raznolikost i virulenciju
sojeva.
HIPOTEZA: Osnovni cilj bio je istražiti utjecaj primjene autogenoga cjepiva na genski
sastav i selekciju sojeva E. coli. Analiza longitudinalno izdvojenih sojeva omogućila bi
detekciju genskih varijacija kroz nekoliko jata, uzimajući u obzir utjecaj primjene
autogenoga cjepiva. Hipoteza istraživanja bila je da kontinuirano cijepljenje jata
autogenim cjepivom utječe na gensku heterogenost i profile virulencije E. coli.
MATERIJALI I METODE: Istraživanje je provedeno na ukupno 115 sojeva E. coli
izdvojenih iz lešina kokoši s dvije odvojene farme roditeljskih jata teške linije genetike
Ross 308. Sojevi su izdvojeni iz četiri i pet jata, na Farmi A, odnosno Farmi B, koje su
dio iste tvrtke. Obje farme imale su kontinuirane probleme uzrokovane temelju morfološke pretrage i biokemijskih karakteristika, a potvrđena MALDI-TOF metodom masene spektrometrije (engl. matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry). Svi uzorci su čuvani u Brain Heart Infusion bujonu s
dodatkom 50%-tnog glicerola pri temperaturi od -20 ºC. Odabir sojeva za daljnje
analize temeljen je na organu podrijetla i dobi životinje. Ciljani organi bili su
peritoneum, jetra, jajovod i koštana srž, s obzirom da su najčešće zahvaćeni u
slučajevima kolibaciloze. Kada sojevi iz odabranih organa nisu bili dostupni, analizirani
su sojevi iz drugih često zahvaćenih tkiva kao što su pluća i perikard. Svi uzorci
izdvojeni su iz životinja starijih od 21 tjedna, kada najčešće dolazi do izbijanja bolesti.
Sojevi su uspoređivani na temelju filogenetskih skupina, održavateljskih gena (engl.
housekeeping genes), skupine odabranih gena virulencije koji su prethodno istraživani
kao moguće odrednice virulencije ExPEC sojeva, detektiranih stečenih gena
rezistencije, te jednonukleotidnih polimorfizama (engl. single-nucleotide
polymorphism, SNP) čitavog genoma istraživanih sojeva.
REZULTATI I DISKUSIJA: Rezultati istraživanja pokazali su postepeno smanjivanje
genske heterogenosti sojeva E. coli nakon kontinuirane primjene autogenoga cjepiva.
Tipizacija sojeva u filogenetske skupine pokazala je nešto veću prevalenciju
komenzalnih sojeva na Farmi A (49.02%) – uzimajući u obzir i udio netipiziranih
sojeva (5.88%). Na Farmi B bili su značajno učestaliji patogeni sojevi (82.3%), te je
posljednje jato bilo izrazito homogeno sa 100%-tnom prevalencijom skupine B2. Na
Farmi A došlo je i do porasta prevalencije komenzalnih sojeva, to jest skupine „cryptic
clade“ u posljednjem jatu (46.2%), koju karakterizira fiziološki visoka prevalencija u
probavnom sustavu ptica.
Filogenetske analize temeljene na MLST (engl. multilocus sequence typing) i
cgSNP (engl. core-genome single-nucleotide polymorphism) metodama potvrdile su da
primjena autogenoga cjepiva uzrokuje smanjenje heterogenosti sojeva, dok je analiza
gena virulencije pokazala suprotno. Kontinuirana primjena cjepiva na Farmi A dovela je
do značajnog porasta prosječnog broja gena virulencije po izolatu kroz vrijeme, dok se
na Farmi B, usprkos početnom porastu, taj broj do kraja istraživanja blago smanjio.
Uspoređujući prosječan broj gena virulencije svih jata, na Farmi B je od početka bio
značajno veći nego na Farmi A. Pojedini čimbenici virulencije prethodno vezani
isključivo uz uropatogene sojeve (engl. uropathogenic E. coli, UPEC), dokazani su u,
zbog čega je započeta primjena autogenoga cjepiva. Prvo jato na obje farme cijepljeno
je komercijalnim cjepivom, dok je primjena autogenoga cjepiva posebno dizajniranog
za svako jato započela u drugom jatu. Uzorci su prikupljeni tijekom patomorfoloških
pretraga uginulih kokoši u sklopu kontinuiranog nadzora na farmi i u slučaju izbijanja
bolesti. Uzorci su uključivali obriske makroskopski promijenjenih organa, te su
nasađeni na tri vrste čvrstih hranjivih podloga. Identifikacija bakterija provedena je na temelju morfološke pretrage i biokemijskih karakteristika, a potvrđena MALDI-TOF
metodom masene spektrometrije (engl. matrix-assisted laser desorption/ionization- time
of flight mass spectrometry). Svi uzorci su čuvani u Brain Heart Infusion bujonu s
dodatkom 50%-tnog glicerola pri temperaturi od -20 ºC. Odabir sojeva za daljnje
analize temeljen je na organu podrijetla i dobi životinje. Ciljani organi bili su
peritoneum, jetra, jajovod i koštana srž, s obzirom da su najčešće zahvaćeni u
slučajevima kolibaciloze. Kada sojevi iz odabranih organa nisu bili dostupni, analizirani
su sojevi iz drugih često zahvaćenih tkiva kao što su pluća i perikard. Svi uzorci
izdvojeni su iz životinja starijih od 21 tjedna, kada najčešće dolazi do izbijanja bolesti.
Sojevi su uspoređivani na temelju filogenetskih skupina, održavateljskih gena (engl.
housekeeping genes), skupine odabranih gena virulencije koji su prethodno istraživani
kao moguće odrednice virulencije ExPEC sojeva, detektiranih stečenih gena
rezistencije, te jednonukleotidnih polimorfizama (engl. single-nucleotide
polymorphism, SNP) čitavog genoma istraživanih sojeva.
REZULTATI I DISKUSIJA: Rezultati istraživanja pokazali su postepeno smanjivanje
genske heterogenosti sojeva E. coli nakon kontinuirane primjene autogenoga cjepiva.
Tipizacija sojeva u filogenetske skupine pokazala je nešto veću prevalenciju
komenzalnih sojeva na Farmi A (49.02%) – uzimajući u obzir i udio netipiziranih
sojeva (5.88%). Na Farmi B bili su značajno učestaliji patogeni sojevi (82.3%), te je
posljednje jato bilo izrazito homogeno sa 100%-tnom prevalencijom skupine B2. Na
Farmi A došlo je i do porasta prevalencije komenzalnih sojeva, to jest skupine „cryptic
clade“ u posljednjem jatu (46.2%), koju karakterizira fiziološki visoka prevalencija u
probavnom sustavu ptica.
Filogenetske analize temeljene na MLST (engl. multilocus sequence typing) i
cgSNP (engl. core-genome single-nucleotide polymorphism) metodama potvrdile su da
primjena autogenoga cjepiva uzrokuje smanjenje heterogenosti sojeva, dok je analiza
gena virulencije pokazala suprotno. Kontinuirana primjena cjepiva na Farmi A dovela je
do značajnog porasta prosječnog broja gena virulencije po izolatu kroz vrijeme, dok se
na Farmi B, usprkos početnom porastu, taj broj do kraja istraživanja blago smanjio.
Uspoređujući prosječan broj gena virulencije svih jata, na Farmi B je od početka bio
značajno veći nego na Farmi A. Pojedini čimbenici virulencije prethodno vezani
isključivo uz uropatogene sojeve (engl. uropathogenic E. coli, UPEC), dokazani su u velikom broju istraživanih izolata, što je također jedan od mogućih pokazatelja da infekcija može nastati ascendentno putem jajovoda. Detektiran je porast prevalencije čimbenika virulencije s funkcijom vezanja i transporta željeza na obje farme. U
usporedbi s drugim skupinama gena virulencije, udio čimbenika transporta željeza bio
je značajno viši. Također je detektirana visoka prevalencija toksin-kodirajućih gena
(>85%), pa tako i bakteriocina, što ukazuje na kompetitivni fenotip istraživanih
bakterija, te moguću dominaciju jednog ili nekoliko sojeva prilikom izbijanja
kolibaciloze na farmama. Osobitosti virulencije sojeva zavisne su o dokazanim ST
profilima (engl. sequence type), potvrđujući mogućnost primjene MLST metode u
istraživanju raznolikosti virulencije sojeva E. coli. Suprotno tome, pojavnost gena
antimikrobne rezistencije (AMR) nije bila specifična za određeni ST.
Analiza gena AMR pokazala je najvišu prevalenciju gena mdf(A) (100%) i sit
operona (71.3%). Ekspresija gena mfd(A) omogućava multirezistentnost sojeva na
različite skupine antimikrobnih pripravaka, što ukazuje na to da su se sojevi prilagodili
uvjetima okoliša posjedovanjem gena AMR širokog spektra. S druge strane, sit operon
geni bitni su čimbenici virulencije zbog njihove funkcije u vezanju i transportu metalnih
iona i rezistenciji na vodikov peroksid, što predstavlja važnu ulogu u patogenezi
kolibaciloze. Prevalencija većine ostalih detektiranih AMR gena bila je značajno niža,
te je iznosila do 4.35%, osim za gen tet(A) koji je detektiran u ukupno 17 izolata
(14.78%). Praćenjem frekvencije AMR kroz vrijeme može se uočiti pad prevalencije,
što je zasigurno i rezultat primjene autogenoga cjepiva koje je smanjilo potrebu za
primjenom antimikrobnih pripravaka u svrhu terapije kolibaciloze na istraživanim
farmama.
ZAKLJUČAK: Primjena autogenoga cjepiva utjecala je na prevalenciju filogenetskih
skupina istraživanih izolata E. coli, pri čemu je došlo do eliminacije slabije virulentnih
sojeva homolognih cijepnim sojevima i perzistencije patogenih, ali uz uspješnu kontrolu
kliničke manifestacije na farmama. Kontinuirana primjena uzrokovala je smanjenje
genetske raznolikosti sojeva, što je dokazano Clermont metodom filotipizacije, te
filogenetskim analizama temeljenima na MLST i cgSNP metodama. Suprotno tome,
nije došlo do smanjenja genske raznolikosti čimbenika virulencije. Prosječan broj
navedenih gena na Farmi A se značajno povećao, dok se na Farmi B blago smanjio.
Profili gena virulencije odgovarali su specifičnim ST-ovima i filogenetskim skupinamaE. coli. Detektirana su 23 ST profila, od čega su ST95, ST117, ST390 i ST23 činili
62.61% od ukupnog broja izolata. Od navedenih, ST95, ST390 i ST131 imali su najveći
prosječan broj gena virulencije po izolatu. Dok je većina ST profila bila prisutna samo
na jednoj farmi, ST117 je izdvojen na objema farmama, što ukazuje na mogućnost
vertikalnog prijenosa iz djedovskih jata ili uzgojnih peradnjaka.
Analiza gena antimikrobne rezistencije pokazala je najveću zastupljenost gena
mdf(A) i sit operona, koji pružaju zaštitu protiv širokog spektra antimikrobnih
pripravaka i omogućavaju patogenezu same infekcije. Ostali geni AMR detektirani su u
bitno manjem broju i njihova pojavnost nije bila vezana uz specifičan ST. Rezultati
ukazuju i na mogući sinergistički učinak terapije i autogenoga cjepiva čime se slabije
virulentni ali rezistentniji sojevi uspješno kontroliraju imunosnim sustavom potaknutim
cjepivom, dok se patogeni ali manje rezistentni sojevi u slučaju izbijanja bolesti mogu
kontrolirati terapijom. |
